Chimica degli oli d’oliva e prove analitiche su campioni di olio

A chiusura delle attività di campo e della sperimentazione relativa alle fasi di estrazione è stata realizzata la sperimentazione finale che ha coinvolto il R.I.A.M. dell’Università di Messina per l’effettuazione di analisi sui campioni di olio d’oliva ottenuti dalle sette aziende della Rete a seguito delle prove di molitura.

Il campionamento è stato effettuato avendo cura di non contaminare in alcuna maniera gli oli ed i campioni opportunamente raccolti in bottiglie di 0,5 litri sono stati immediatamente etichettati e sigillati.

L’effettuazione delle analisi ha riguardato gli esami di seguito riportati:

·        Determinazione dell’acidità

·        Determinazione del numero di perossidi

·        Determinazione del numero totale dei polifenoli

·        Determinazione gascromatografica del contenuto in cere

·        Determinazione gascromatografica degli esteri metilici degli acidi grassi

·        Analisi spettrofotometrica UV

Le metodologie analitiche applicate sono riportate nel Regolamento CEE 2568/91 della Commissione e successivi aggiornamenti, ad eccezione della determinazione del contenuto totale in polifenoli che è stata eseguita con un metodo analitico di piena attendibilità tratto dalla letteratura scientifica, stante il fatto che il regolamento di cui sopra non riporta una metodica specifica per tali componenti. Di seguito si riporta sommariamente, per ciascuna determinazione, il procedimento analitico:

-Per la determinazione dell’acidità un’aliquota di ciascun campione di olio è stata solubilizzata in una soluzione di etere dietilico/alcol etilico 95% in miscela 1:1 (v/v) e titolata con una soluzione etanolica di idrossido di potassio 0,1 mol/l, utilizzando come indicatore la fenolftaleina; i risultati sono stati espressi come percento di acido oleico.

-La determinazione del numero di perossidi è stata effettuata trattando con una soluzione di ioduro di potassio l’olio in esame, previamente solubilizzato in cloroformio e acido acetico e titolando lo iodio liberato con una soluzione di tiosolfato di sodio 0,002 o 0,01 N, in funzione del numero di perossidi. I risultati sono stati espressi in milliequivalenti di ossigeno attivo per kg di olio.

-Per la determinazione del contenuto delle cere (esteri alifatici) l’olio, addizionato di una opportuna quantità di lauril arachidato come standard interno, è stato frazionato mediante cromatografia su colonna di gel di silice idratato, utilizzando n-esano/etere dietilico 99:1 come eluente. La frazione eluita per prima nelle condizioni di prova (avente polarità inferiore a quella dei trigliceridi) veniva recuperata, evaporata a secchezza, ripresa con n-eptano e quindi analizzata direttamente mediante gascromatografia. L’analisi gascromatografica è stata condotta utilizzando una colonna capillare in silice fusa lunga 15 m, diametro interno 0,25 mm, ricoperta internamente con liquido SE 52 equivalente, spessore uniforme di 0,25 µm, con un opportuno programma di temperatura da 80 °C a 340 °C. L’identificazione dei singoli esteri alifatici è stata effettuata impiegando standard puri, mentre per la determinazione quantitativa è stato utilizzato il metodo dello standard interno. I risultati sono stati espressi come somma del contenuto di ogni singolo estere alifatico da C40 a C46, in mg/kg di olio.

-Gli acidi grassi liberi sono stati determinati attraverso l’analisi gascromatografica dei corrispondenti esteri metilici, preparati mediante transesterificazione a freddo con soluzione metanolica di idrossido di potassio N2. L’analisi gascromatografica è stata eseguita con colonna capillare in silice fusa lunga 25 metri, diametro interno 0,32 mm, ricoperta con polietilenglicole chimicamente legato, dello spessore di 0,25 µm, avente un numero di piatti teorici superiore a 75.000. Per l’identificazione dei diversi esteri metilici è stata utilizzata una miscela di standard puri, mentre l’analisi quantitativa è stata effettuata con il metodo della normalizzazione interna; ogni singolo componente è stato espresso come percentuale in massa.

L’analisi spettrofotometrica è stata effettuata misurando l’estinzione degli oli ad opportune lunghezze d’onda nella zona dell’ultravioletto. Ciascun campione di olio è stato filtrato su carta da filtro e per la determinazione spettrofotometrica un’aliquota è stata diluita in isottano. Sono stati riportati i valori dell’estinzione specifica, misurata alle lunghezze d’onda di 232 e 270 nm, e del ∆K, calcolato misurando le estinzioni oltre che a 270 nm anche a 266 e 274 nm.

Il contenuto in polifenoli, infine, è stato misurato mediante analisi spettrofotometrica nel visibile, previa separazione dei composti dalla matrice liposolubile e calcolato come quantità equivalenti di acido gallico (GAE). Il metodo utilizzato prevede l’estrazione dei composti tramite LLE (liquid/liquid extraction) con metanolo-acqua dall’olio e successivo saggio colorimetrico con il Reattivo Folin-Ciocalteau, eseguito sulla fase polare. Nello specifico, un’aliquota di olio è stata trattata con metanolo-acqua 80:20 per estrarre i composti fenolici; dopo agitazione energica la soluzione è stata raffreddata a 5 °C e centrifugata a 3500 rpm. Su una frazione della fase polare è stato effettuato il saggio colorimetrico, utilizzando a tale scopo una soluzione diluita 1:9 in acqua del reattivo di Folin-Ciocalteau e una soluzione acquosa al 7,5 % di carbonato sodico. La lettura spettrofotometrica è stata effettuata a 765 nm e i risultati sono stati espressi in mg/kg di olio.

I risultati delle analisi sono riportati nelle schede tecniche che seguono.

Le operazioni sono state più articolate e laboriose rispetto a quanto programmato, infatti a causa di uno slittamento nella consegna delle stesse, motivate dal R.I.A.M. con gli elevati tempi tecnici richiesti per i vari esami, con i ritardi nel reperimento dei reagenti chimici necessari per l’effettuazione delle analisi e con il sovrapporsi delle festività Natalizie, non si è riusciti a chiudere le attività di progetto nei tempi previsti ed è stato necessario chiedere una seconda breve proroga.

Dai risultati delle analisi si evince in maniera evidente la ottima qualità degli oli prodotti, tutti rientrano infatti nella categoria degli oli extravergini di oliva, presentando una acidità sempre al di sotto di 0,8 (espressa in percentuale di acido oleico).

Le variabili che entrano in gioco nella determinazione delle caratteristiche di un olio d'oliva dipendono da molti fattori: cultivar, ambiente pedo-climatico, sistema di coltivazione, epoca e sistema di raccolta delle olive, tecnologia e modalità di trasformazione, e conservazione del prodotto.

Gli oli d'oliva si differenziano sia per caratteristiche organolettiche (aroma, odore, sapore), sia per le caratteristiche chimiche (composizione, acidità, ecc.). Molti di questi fattori che influenzano la qualità di un olio non sono modificabili (per esempio le condizioni pedo-climatiche), in quanto peculiari di una determinata zona di produzione, altri invece possono essere facilmente adattabili, come le tecniche colturali e le modalità di estrazione. L'olio d'oliva è un grasso che si presenta allo stato fisico liquido a temperatura ambiente (20°C), ed è costituito da un punto di vista chimico per il 98-99% da una miscela di trigliceridi detta frazione "saponificabile" e per il rimanente 1-2% da un insieme di composti che rappresentano la frazione "insaponificabile".

Frazione gliceridica o saponificabile

I trigliceridi differiscono tra loro per la natura degli acidi grassi e/o per la posizione che questi ultimi occupano nella relativa struttura chimica; gli acidi grassi a loro volta a secondo del grado di saturazione da parte degli atomi di idrogeno vengono distinti in acidi grassi saturi e insaturi. Sono acidi grassi saturi tutti i grassi che si presentano con consistenza solida in natura (molto diffusi nei grassi animali), mentre gli insaturi si presentano in natura con consistenza liquida a temperatura ambiente e sono rappresentati da acidi grassi monoinsaturi e polinsaturi a secondo della presenza di uno o più doppi legami (i doppi legami conferiscono maggiore fluidità, abbassano il punto di fusione e rendono l'olio meno stabile poiché attaccabile facilmente dall'ossigeno).

Analizzando la composizione acidica dell'olio d'oliva, è evidente che la frazione monoinsatura, rappresentata dall'acido oleico, è la più abbondante (fino all'83%) e tutti gli altri presentano percentuali molto inferiori; per esempio gli acidi grassi saturi come il palmitico e lo stearico, sono presenti nell'olio d'oliva rispettivamente con valori compresi tra 5,7% e 18,6% e 0,5% e 4,0%. Tra gli acidi grassi polinsaturi prevalgono nell'olio d'oliva l'acido linolenico e linoleico, generalmente indicati come "acidi grassi essenziali" (AGE) poiché indispensabili per l'accrescimento e funzionamento dei tessuti, e l'uomo non è in grado di sintetizzarli; le percentuali sono rispettivamente tra 0,1% e 0,6% e 3,5% e 20,0%.

L'elevato contenuto di acidi grassi monoinsaturi rappresenta l'elemento distintivo dell'olio d'oliva rispetto agli altri grassi di origine vegetale.

Frazione insaponificabile

I costituenti minori dell'olio d'oliva, detti “insaponificabile”, rappresentano l'1-2% del totale. Si tratta della componente che diversifica questo prodotto dagli altri grassi liquidi e comprende circa 220 sostanze.

Alcuni di questi costituenti dell'olio d'oliva hanno valore terapeutico, altri rappresentano la parte principale della nota aromatica dell'olio (profumi-sapori), altri ancora sono efficaci antiossidanti naturali in grado di conferire al prodotto resistenza all'invecchiamento. Tra essi si evidenziano: idrocarburi, tocofenoli, composti fenolici, alcoli, steroli, pigmenti colorati ed elementi secondari.

Gli idrocarburi rappresentano circa il 60% dell'insaponificabile, e di questi il 60-70% è rappresentato dallo squalene (idrocarburo saturo) che incide sulle proprietà nutrizionali degli oli, mentre la restante parte svolge funzione preminente per l'accertamento delle caratteristiche di genuinità e qualità del prodotto;

I tocofenoli nell'olio d'oliva sono presenti con le forme α, β, γ e δ. Il 90% della componente tocofenolica è nella forma α, che è anche quella biologicamente più attiva e nota come vitamina E. I tocofenoli sono antiossidanti naturali che inibiscono il processo di irrancidimento del prodotto, e per svolgere questa funzione protettiva occorre che il rapporto tra quantitativo di vitamina E (mg) e quello di acidi polinsaturi (g) non sia inferiore a 0,79 mg/g;

Le piante oleaginose hanno una composizione percentuale della frazione sterolica diversa per ciascuna specie. Nell'olio d'oliva, dove prevale la frazione del β-sitosterolo, sono stati identificati i seguenti steroli: colesterolo (prevalente nei grassi animali), campesterolo, uvaolo, stigmasterolo, clerosterolo, eritrodiolo e β-sitosterolo. Questi composti svolgono funzione di antiossidanti naturali, ed inoltre accertano la genuinità del prodotto poiché la frazione sterolica è diversa per ogni tipo di pianta oleaginosa;

I composti fenolici dell'olio d'oliva differiscono da quelli contenuti nelle olive, e il loro aspetto quali-quantitativo è fortemente condizionato dalla varietà, stadio di maturazione al momento della raccolta e dal processo di estrazione. Infatti, essendo idrosolubili, durante il processo di estrazione una parte consistente di polifenoli viene allontanata con le acque di vegetazione; inoltre è noto che le azioni enzimatiche che avvengono durante l'estrazione determinano la scissione in molecole più semplici rispetto a quelle che si trovano nell'oliva. Gli oli di oliva vergine ed extra-vergine comunque sono gli unici grassi vegetali che contengono naturalmente quantità apprezzabili (50-500 mg/kg) di sostanze fenoliche; il riferimento agli oli vergini non è casuale perchè qualsiasi tipo di manipolazione chimica di rettificazione si compia su questo prodotto non può che distruggere completamente il patrimonio fenolico naturale.

Il potere antiossidante dei polifenoli, evidenziato da alcuni studiosi, ha consolidato l'importante ruolo che questi composti svolgono sulla stabilità dell'olio d'oliva; la letteratura è ricca di informazioni che mettono in rilievo la correlazione positiva tra quantità di polifenoli totali in oli vergini e la resistenza nel tempo all'ossidazione (periodo di induzione). Inoltre, studiosi hanno evidenziato l'azione sinergica tra polifenoli e α-tocofenoli (vitamina E) sulla stabilità dell'olio d'oliva vergine;

I pigmenti colorati impartiscono le colorazioni caratteristiche all'olio d'oliva, essi sono rappresentati da clorofille e carotenoidi. Le clorofille di tipo a e b conferiscono agli oli appena estratti il colore verde intenso, possono oscillare tra 0 a 10 ppm, e anch'essi variano in relazione alla cultivar ed allo stadio di maturazione dei frutti. Queste sostanze meritano attenzione poiché in presenza di luce agiscono sull'olio come proossidanti, mentre al buio, in sinergia con i fenoli lo proteggono dall'ossidazione;

Gli alcoli dell'olio si dividono in alcoli alifatici ed alcoli triterpenici, essi si trovano esterificati nelle cere ed hanno una grande importanza analitica, per l'individuazione degli oli ottenuti mediante estrazione con solvente oppure mediante pressione meccanica;

Altri elementi secondari quali aldeidi, terpeidi, esteri, chetoni, ecc. influenzano la nota aromatica dell'olio e quindi composti coinvolti nella sua valutazione edonistica.

Importantissima la rilevazione analitica dei perossidi, questi sono presenti nell'olio di oliva ed il loro contenuto ne attesta il suo stato di ossidazione primaria e quindi la sua tendenza ad irrancidire. Gli acidi grassi insaturi, infatti, reagiscono con l’ossigeno formando i perossidi, che determinano una serie di reazioni a catena con produzione ultima di sostanze volatili dotate del caratteristico odore di rancido. Tali reazioni vengono accelerate dalle alte temperature e dall’esposizione alla luce e all’ossigeno. Gli oli in buono stato di conservazione risultano avere un numero di perossidi inferiore a 10; un numero superiore sta a indicare, per gli oli vergini, l'inizio dell'alterazione. Più basso è il numero di perossidi e migliore è quindi la qualità dell’olio di oliva rispetto alla sua serbevolezza.

Il tenore di acidità dell'olio di oliva è dato dalla quantità di acidi grassi liberi derivanti dall’irrancidimento idrolitico dei trigliceridi. Questa alterazione si verifica in condizioni non idonee di trattamento e conservazione dell’olio di oliva e quindi l’acidità rappresenta un indicatore fondamentale della genuinità del prodotto. L'acidità può essere presa come un buon indicatore del corretto procedimento della raccolta e dello stoccaggio delle olive prima della loro frangitura finale.

Il potere antiossidante dei polifenoli svolge un ruolo importante per la stabilità dell'olio d'oliva in quanto esiste una correlazione diretta tra la quantità di polifenoli totali e la resistenza nel tempo all'ossidazione.

I polifenoli svolgono un’azione protettiva non solo sull’olio ma anche sulle cellule del corpo umano poiché contrastano l’effetto negativo dei radicali liberi (anti-age).

La quantità di polifenoli contenuta nell’olio dipende dal tipo di cultivar, dal periodo di raccolta, dalle caratteristiche del terreno e dal processo di estrazione.

Il test dei polifenoli permette di verificare la qualità dell’olio ma anche di intervenire nel processo di estrazione, modificando i parametri che incidono in modo negativo sul contenuto finale della sostanza; ad esempio risulta altamente penalizzante l’aggiunta di acqua ed in particolare di acqua calda (al di sopra dei 30 °C) in fase di estrazione dell’olio, essendo i polifenoli sostanze idrosolubili e termolabili.

La sperimentazione “Frantolio” è stata effettuata su frantoi a due fasi per garantire sugli oli prodotti la massima presenza di polifenoli. Negli impianti a due fasi infatti il processo estrattivo non richiede acqua di diluizione in aggiunta alla pasta di olive, ad eccezione di rari casi e per piccolissime quantità.